測序文庫的定量分析和質(zhì)量評價對于獲得高質(zhì)量的核酸測序數(shù)據(jù)十分關(guān)鍵。因為： 1.如果測序文庫拷貝數(shù)偏低，將不能獲得足夠的測序數(shù)據(jù)，導(dǎo)致降低數(shù)據(jù)產(chǎn)出; 2.如果測序文庫拷貝數(shù)過高，將產(chǎn)生低質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，甚至?xí)?dǎo)致測序失敗。 因此，要控制NGS測序儀上測序文庫的載入量，保證測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，就需要在測序前對DNA測序文庫進(jìn)行定量分析。 常用的文庫定量方法有紫外分光光度法、熒光染料法以及實時熒光定量PCR法。 紫外分光光度法★ 核酸，包括DNA和RNA，均由核糖、磷酸基以及堿基構(gòu)成。其中，由于堿基含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，因此具有紫外吸收的特性。核酸的紫外吸收峰在260nm處，與此同時，還能通過計算A260/A280和A260/A230的數(shù)值，估計核酸的純度。（280 nm吸光通常來自蛋白質(zhì)，而230 nm則通常來自糖類和苯酚等）。 但是紫外分光光度法無法區(qū)分DNA和RNA，因為具有紫外吸收的結(jié)構(gòu)是核酸的堿基，而DNA和RNA均含有堿基，因此當(dāng)一份樣品同時含有DNA和RNA的時候，測定濃度會高于其真實濃度。 熒光染料法 ★ 使用靶標(biāo)特異性染料，該染料可以特異地與不同種類的核酸鏈相結(jié)合，并在特定波長光源的激發(fā)下，發(fā)出熒光。其中，結(jié)合了核酸的熒光染料，相比那些游離的，信號可增幅數(shù)十倍至數(shù)百倍，因此可以和背景區(qū)分開來。在測量過程中，首先將待測DNA樣品與熒光染料混合，熒光染料會與DNA結(jié)合，形成熒光復(fù)合物。然后，將混合物放入Qubit測量儀器中，儀器會通過激光激發(fā)熒光復(fù)合物，使其發(fā)出熒光信號。Qubit測量儀器會根據(jù)熒光信號的強(qiáng)度自動計算出DNA的濃度，基本是測序?qū)嶒炇业臉?biāo)配儀器。 目前，雙鏈和單鏈DNA、RNA及蛋白質(zhì)均有特異的熒光染料，無需專門純化樣品，或者在未知污染程度的情況下，使用Qubit可以方便地得知濃度信息。 實時熒光定量PCR法 ★ qPCR法利用熒光檢測技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過實時監(jiān)測整個PCR過程中熒光信號的變化情況，反映濃度的變化，*后通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算未知樣品的濃度，以達(dá)到準(zhǔn)確定量文庫濃度。由于其特異性引物僅會定量兩端接頭連接完整的文庫，可排除單端或雙端都不連接接頭的不可測序文庫的干擾，因此qPCR法作為文庫定量的金標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確性**。 文庫定量時，Qubit定的是樣本中所有核酸dsDNA的濃度（以dsDNA為例），包含未連接接頭的dsDNA片段，不能很好地體現(xiàn)出文庫中有效文庫的實際濃度，其結(jié)果一般不作為終濃度用于上機(jī)。而qPCR僅測定標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)的文庫序列，非標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)序列占比較大會導(dǎo)致Qubit測定值高于qPCR濃度值。 結(jié)論： 基于紫外分光光度的測定方法相對不夠精準(zhǔn)定量，更適用于檢測提取后核酸的濃度。Qubit檢測的**度略低，但快速的檢測流程和包含的定量軟件使其成為文庫常規(guī)定量的理想選擇。基于qPCR的檢測方法的**度更高，是目前業(yè)內(nèi)進(jìn)行文庫定量*推薦的方法，適用于測量珍貴樣本以及文庫上機(jī)pooling前的精準(zhǔn)定量。 杭州沃森文庫定量產(chǎn)品推薦
