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文庫構(gòu)建概念

DNA文庫構(gòu)建是二代測序技術(shù)的基礎(chǔ)，其目的是將待測定樣本的大片段基因組DNA片段化為小片段的DNA，之后在小片段DNA分子兩端添加測序接頭，形成能上機(jī)測序的有效文庫的過程。文庫構(gòu)建，*終是將待測的DNA或RNA樣本轉(zhuǎn)化為適合測序的文庫。

文庫構(gòu)建流程

1.打斷及末修: 將DNA或RNA打斷為適合測序平臺的片段大小并修復(fù)末端損傷

2.加接頭：在片段兩端加上特定的接頭序列

3.DNA純化：去除文庫中的雜質(zhì)，提高文庫質(zhì)量

4.文庫擴(kuò)增：通過PCR擴(kuò)增文庫，增加文庫的產(chǎn)量

5.文庫質(zhì)檢：評估文庫的質(zhì)量，包括文庫的濃度、片段大小分布、純度以及是否存在污染等，以確保文庫符合測序要求

文庫構(gòu)建方法

DNA建庫方法是分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)原理，其本質(zhì)就是在待測片段兩端加上接頭的過程，由于NGS測序的應(yīng)用廣泛，不同應(yīng)用方向的文庫制備流程仍有較大差異，目前建庫方法包括以下四種。

1. 物理/酶切打斷建庫

通過物理或酶切打斷基因組DNA，然后通過連接酶將接頭連接到DNA片段上，*后通過PCR擴(kuò)增。這種方法可以有效保留樣本的幾乎所有基因組信息，適用于全基因組測序。包括TA連接接頭建庫、平末端連接接頭建庫、Swift法建庫！

2. 轉(zhuǎn)座酶建庫

轉(zhuǎn)座酶法建庫技術(shù)的關(guān)鍵是Tn5轉(zhuǎn)座子，Tn5轉(zhuǎn)座子是一種細(xì)菌轉(zhuǎn)座子，本質(zhì)是一段含有若干抗性基因和編輯轉(zhuǎn)座酶基因的DNA片段。轉(zhuǎn)座酶建庫利用Tn5轉(zhuǎn)座子將DNA片段化、末端修復(fù)、接頭連接等多步反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)橐徊椒磻?yīng)，大大縮短了建庫時(shí)間。起始量低至1ng，適用于珍貴的樣本或低核酸含量的樣本。

3. 雜交捕獲建庫

雜交捕獲根據(jù)核酸分子堿基互補(bǔ)配對原則，針對目標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)特異探針，打斷基因組DNA,加上測序接頭后與探針雜交,將基因組DNA目標(biāo)區(qū)域捕獲下來，回收目標(biāo)DNA片段即可。

4. PCR擴(kuò)增子建庫

擴(kuò)增子建庫是指利用PCR反應(yīng)在待測DNA片段兩端加上接頭的方法，原理相對比較簡單，只需要兩輪PCR和兩步純化就可以得到目標(biāo)區(qū)域的文庫，**步是含通用序列的引物與目標(biāo)區(qū)域結(jié)合，第二步通過PCR反應(yīng)連接測序接頭，使得構(gòu)建的文庫可以用于上機(jī)測序。

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